靶向“不可成藥”轉(zhuǎn)錄因子的新思路及進(jìn)展

       轉(zhuǎn)錄因子介紹

       轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與特定DNA 結(jié)合序列結(jié)合來(lái)幫助打開(kāi)或關(guān)閉基因，調(diào)控了幾乎整個(gè)基因組。所有轉(zhuǎn)錄因子 (TF) 都包含兩個(gè)通用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)與特定 DNA序列結(jié)合的 DNA 結(jié)合域 (DBD)，一個(gè)招募共激活因子的效應(yīng)域。許多轉(zhuǎn)錄因子還包含一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域通常用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子定位和功能，例如STAT3，通過(guò)其SH2結(jié)構(gòu)域來(lái)實(shí)現(xiàn)二聚化并調(diào)控靶基因的表達(dá)。

       據(jù)估計(jì)，人類(lèi)基因組中至少有 1,600 個(gè) TF，其中約 19% 與疾病表型相關(guān)。如 p53、Myc、雄激素受體 (AR)、雌激素受體 (ER) 、缺氧誘導(dǎo)因子 (HIF)、NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，它們參與各種促癌事件，p53 是研究最多的腫瘤抑制因子，在超過(guò) 50% 的人類(lèi)癌癥中發(fā)生功能獲得性突變失活或變成致癌物。核受體 AR 和 ER 分別與內(nèi)分泌驅(qū)動(dòng)的前列腺癌和女性癌癥（如乳腺癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌）的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。HIF-1在大多數(shù)實(shí)體瘤中過(guò)度表達(dá)。NF-κB是經(jīng)典激活巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)產(chǎn)生大量炎癥因子。

       轉(zhuǎn)錄因子在選擇性基因調(diào)控中起基礎(chǔ)作用，因此比激酶等上游信號(hào)蛋白具有更高特異性的疾病調(diào)節(jié)能力，并且由于基因靶標(biāo)受DNA 結(jié)合特異性控制，所以單個(gè) TF 通常只調(diào)節(jié)有限的一組基因靶標(biāo)，因此這種抑制劑也不容易其他藥物常見(jiàn)的補(bǔ)償性耐藥機(jī)制。所以靶向異常的轉(zhuǎn)錄因子是一種有效治療疾病的策略。

       但由于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性，并缺乏活性位點(diǎn)，傳統(tǒng)上認(rèn)為其難以成藥。研究表明轉(zhuǎn)錄因子存在高度動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)-DNA 和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)-DNA 相互作用界面通常是凸面且?guī)д姾?，而蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用界面通常更平坦且缺乏結(jié)合袋，小分子很難直接靶向。

       靶向轉(zhuǎn)錄因子的小分子抑制劑

       其中，核受體 (NRs)和bHLH-PAS家族是類(lèi)特殊的 TF 家族，其具有一個(gè) DNA 結(jié)合域 (DBD) 和一個(gè)配體結(jié)合域 (LBD)，bHLH-PAS家族是通過(guò)與其家族成員二聚化形成LBD。當(dāng)與小分子配體結(jié)合時(shí)，會(huì)誘導(dǎo) NRs 構(gòu)象變化，調(diào)節(jié)它們與各種轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)節(jié)因子（如共激活因子或輔助抑制因子）的相互作用，從而控制下游靶基因的表達(dá)，目前開(kāi)發(fā)的小分子抑制劑主要靶向這兩類(lèi)TFs。

       核受體包括雄激素AR、雌激素ER等。AR與 AR LBD 的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞核易位并啟動(dòng)靶基因表達(dá)，這是前列腺癌的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，因此 AR 是一種重要的治療靶點(diǎn)。AR拮抗劑與LBD結(jié)合會(huì)阻斷AR信號(hào)通路，恩雜魯胺、阿帕魯胺和darolutamide是第二代AR拮抗劑，最近已被FDA批準(zhǔn)用于治療人類(lèi)前列腺癌，與第一代相比療效更強(qiáng)，副作用減少。此外，一些AR拮抗劑正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，如proxalutamide和EPI-7386。為避免不良副作用（如AR信號(hào)通路對(duì)肌肉和骨骼的合成發(fā)揮代謝作用），在過(guò)去的二十年中合成和開(kāi)發(fā)了選擇性AR調(diào)節(jié)劑（SARMs），如GTx-024，AR或 SARM 與 AR LBD 結(jié)合并誘導(dǎo)構(gòu)象變化，從而促進(jìn)募集共激活因子，并激活基因表達(dá)。

       大約 75% 的乳腺癌都是 ER 陽(yáng)性的， ER 信號(hào)傳導(dǎo)是乳腺癌的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。選擇性ER調(diào)節(jié)劑SERM（如他莫昔芬）與 LBD 結(jié)合，阻斷募集共激活因子所需的構(gòu)象變化，從而降低靶基因表達(dá)。

       盡管AR或ER的抑制劑或選擇性調(diào)節(jié)劑能降低靶基因表達(dá)，但內(nèi)在和獲得性抗性的出現(xiàn)限制其應(yīng)用。以事件驅(qū)動(dòng)的方式誘導(dǎo)靶蛋白質(zhì)降解的 PROTAC 技術(shù)在克服這個(gè)問(wèn)題方面顯示出巨大前景，將在下文介紹。

       最后，盡管 NR 由于LBD的存在最易成藥，但靶向 NR所有家族成員仍然是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。例如那些被稱(chēng)為孤兒受體的 NR，其沒(méi)有指定的內(nèi)源性配體或明顯的配體結(jié)合口袋。此外在某些疾病中， NR 剪接變體的出現(xiàn)會(huì)使傳統(tǒng)藥物失效，例如 AR-V7，為 AR 的剪接變體。傳統(tǒng)的 NR 靶向藥物都是與其 LBD 口袋結(jié)合。最近，NR 共激活因子結(jié)合抑制劑也被開(kāi)發(fā)用于調(diào)節(jié) NR 活性。

       蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (PPI) 在許多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并且在疾病中經(jīng)常失調(diào)。因此，PPI 也被認(rèn)為是潛在的治療靶點(diǎn)。例如p53-MDM2抑制劑和menin-MLL抑制劑。在癌癥中，TF p53（“基因組的守護(hù)者”）和泛素 E3 連接酶 MDM2 之間的 PPI 通常作為癌細(xì)胞通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)下調(diào) p53 水平來(lái)逃避凋亡的機(jī)制。然而p53 是一種高度無(wú)序的 TF，因此開(kāi)發(fā)一種與 p53 結(jié)合并使其免受蛋白酶體降解制的小分子極具挑戰(zhàn)性。幸運(yùn)的是MDM2 的 p53 結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)相對(duì)較小且定義明確的疏水口袋，因此可以設(shè)計(jì)抑制它們相互作用的小分子藥物，如HDM201 和 RG7388來(lái)抑制p53的泛素化。

       共激活因子menin與MLL融合蛋白的相互作用對(duì)于 MLL 融合陽(yáng)性白血病是必不可少的，因此開(kāi)發(fā)小分子抑制劑對(duì)治療白血病有效，例如已經(jīng)開(kāi)發(fā)的MI-538 和 MI-1481，通過(guò)阻斷其相互作用而抑制白血病。

       但蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面通常是疏水性的，難以開(kāi)發(fā)具有理想成藥性質(zhì)的小分子化合物。與酶的活性位點(diǎn)或受體的結(jié)合位點(diǎn)相比，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用界面更加平坦穩(wěn)定，難以靶向。此外，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)界面相對(duì)沒(méi)有特征，缺乏可以完全容納小分子配體的疏水腔。因此蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用抑制劑的未來(lái)發(fā)展方向應(yīng)該是優(yōu)先設(shè)計(jì)新的化學(xué)、生物和計(jì)算工具，并且擴(kuò)大化學(xué)庫(kù)以篩選有效小分子。

       靶向轉(zhuǎn)錄因子的PROTAC降解劑

       在細(xì)胞中，必須破壞不必要或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以確保細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，這個(gè)過(guò)程受到細(xì)胞內(nèi)泛素蛋白酶體機(jī)制的嚴(yán)格控制。通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)劫持內(nèi)源性 E3 連接酶降解感興趣的蛋白質(zhì) (POI)，開(kāi)發(fā)了靶向蛋白水解的嵌合體 (PROTAC)。PROTAC 是一種異雙功能分子，含有一個(gè)與 POI 結(jié)合的配體和一個(gè) E3 泛素連接酶的共價(jià)連接配體，通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)靶標(biāo)的降解。

       與傳統(tǒng) SMI 的占用驅(qū)動(dòng)操作模式不同，PROTAC 以事件驅(qū)動(dòng)的方式降解POI，無(wú)需分離配體來(lái)識(shí)別靶向 POI ，提供了一種新的策略來(lái)抑制以前無(wú)法成藥的靶標(biāo)，且具有較強(qiáng)的靶標(biāo)選擇性，并有可能克服傳統(tǒng) SMI 常見(jiàn)的耐藥性。ROTACs 能消除靶蛋白的所有功能，而不僅僅是特定小分子抑制劑所靶向的活性。并且這種方法也是催化的，允許單個(gè)分子通過(guò)重復(fù)的結(jié)合和降解循環(huán)介導(dǎo)多個(gè)靶蛋白的破壞，可以減少給藥頻率。但也有一些局限性，如不良的藥代動(dòng)力學(xué)特征、嚴(yán)重依賴E3泛素連接酶和存在潛在脫靶毒 性。

       目前靶向AR的PROTAC研究很多。2008 年，Crews 實(shí)驗(yàn)室報(bào)告了第一個(gè) PROTAC AR 降解劑，該降解劑使用 MDM2 抑制劑作為 E3 連接酶配體,比卡魯胺作為 AR 拮抗劑。雖然化合物131僅在微摩爾濃度下降解細(xì)胞中的 AR 蛋白，但它提供了重要的概念驗(yàn)證。

       化合物135-137用高效的AR拮抗劑和VHL配體設(shè)計(jì)PROTAC，盡管都具有出色的降解能力，但在動(dòng)物體內(nèi)的口服生物利用度較低，這限制了其進(jìn)一步發(fā)展。ARD69 和 ARD266 表明，具有高剛性接頭的 PROTAC 能提高活性。

       由高效的 AR 配體和帶有剛性接頭的 CRBN 配體設(shè)計(jì)的 AR PROTAC 已顯示出優(yōu)異的 AR 降解效力、有效的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性、良好的 PK 曲線以及有效的抗腫瘤功效。目前ARV-110已進(jìn)入臨床二期，它由強(qiáng)效抑制劑，CRBN配體通過(guò)剛性連接子相連，具有非常出色的AR降解效力、在野生型和具有 AR T878A 和 H875Y 突變體的前列腺癌患者中效果明顯。Avinas 還有一款口服PROTAC 藥物ARV-766正在進(jìn)行臨床一期試驗(yàn)。

       盡管目前已研發(fā)出大量的激動(dòng)劑和拮抗劑，但報(bào)道的 AR PROTAC 僅使用少數(shù) AR 抑制劑及其衍生物，包括比卡魯胺、恩雜魯胺和化合物72來(lái)自輝瑞，且只有 CRBN 配體才能提供良好的口服生物利用度。

       信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子 3 (STAT3) 是 STAT 家族的成員，可響應(yīng)各種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和癌基因信號(hào)而被激活，其激活通常與預(yù)后不良有關(guān)。STAT3通過(guò)一個(gè)Tyr705位點(diǎn)磷酸化的單體與另一個(gè)單體的SH2結(jié)合域的結(jié)合口袋相互作用進(jìn)行二聚化，隨后激活靶基因。因此STAT3 SH2 結(jié)構(gòu)域的抑制劑能抑制STAT3活性。但 STAT3 和其他 STAT 家族成員共享一個(gè)高度結(jié)構(gòu)同源的 SH2 結(jié)構(gòu)域，難以獲得高度選擇性的 STAT3 抑制劑。并且單體 STAT3 蛋白也具有轉(zhuǎn)錄活性，因此阻斷 STAT3 二聚化的 STAT3 SH2 結(jié)構(gòu)域抑制劑僅部分抑制 STAT3 的基因轉(zhuǎn)錄活性。研究人員通過(guò)優(yōu)化以前的 STAT3 SH2 結(jié)構(gòu)域抑制劑 CJ-887，開(kāi)發(fā)了一種可滲透細(xì)胞的 高效STAT3 降解劑SD-36。

       Forkhead box M1 (FOXM1)，是一種對(duì)細(xì)胞分裂至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXM1 轉(zhuǎn)錄活性增加與癌癥患者的不良預(yù)后有關(guān)。對(duì)FOXM1 的 DNA 結(jié)合域進(jìn)行計(jì)算機(jī)建模，確定了一種合適的抑制 FOXM1-DNA 相互作用的小分子，并設(shè)計(jì)了一種基于 CRBN 的 PROTAC，可顯著降解 FOXM1 蛋白并具有抗腫瘤活性。

       與經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄活性抑制劑相比，這些基于小分子的 PROTAC 具有改善的口服生物利用度、低毒 性和卓越療效等優(yōu)點(diǎn)，目前這些針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的PROTACs正處于I期和II期臨床試驗(yàn)中。

       如上所述，SMI 可以靶向 AR、ER 和 STAT3 等一些轉(zhuǎn)錄因子，從而可以基于這些 SMI 設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā) PROTAC。然而，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子仍然無(wú)法成藥或難以成藥。轉(zhuǎn)錄因子以序列特異性方式識(shí)別啟動(dòng)子和增強(qiáng)子 DNA 中的順式調(diào)節(jié)元件，但這些關(guān)鍵功能位點(diǎn)也難以設(shè)計(jì)SMI。利用轉(zhuǎn)錄因子具有特定 DNA 結(jié)合序列這一特點(diǎn)，目前幾項(xiàng)研究已使用這些寡核苷酸序列作為配體，開(kāi)發(fā) PROTACs 用于靶向降解轉(zhuǎn)錄因子。

       Crews開(kāi)發(fā)了一種 TRAFTAC（靶向轉(zhuǎn)錄因子的嵌合體），它使用異雙功能雙鏈 DNA/CRISPR-RNA 嵌合體同時(shí)結(jié)合感興趣的轉(zhuǎn)錄因子 (TOI) 和 dCas9-HaloTag7 融合蛋白 (dCas9-HT7，用作中間蛋白) 。CRISPR-RNA 與異位表達(dá)的 dCas9-HT7 結(jié)合，后者又在 haloPROTAC 存在下招募 VHL E3 連接酶復(fù)合物。然后嵌合體的雙鏈 DNA 部分識(shí)別 TOI 并使 TOI 和 E3 復(fù)合物接近誘導(dǎo)TOI 降解。作為概念驗(yàn)證，他們首先選擇了典型的癌基因 NF-κB 作為靶點(diǎn)。NF-κB-TRAFTAC 與 dCas9-HT7 融合蛋白和 NF-κB 亞基 p50 結(jié)合，在 haloPROTAC 處理后誘導(dǎo) p50 顯著降解。

       為了開(kāi)發(fā)一種更直接的方法來(lái)降解轉(zhuǎn)錄因子，研究人員通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)將 DNA 寡核苷酸鏈與 E3 連接酶配體連接，以選擇性降解TOI，稱(chēng)為 TF-PROTAC。

       通過(guò)無(wú)金屬銅響應(yīng)的疊氮化物-炔烴環(huán)加成 (SPAAC) 反應(yīng)將市售的疊氮化物修飾的 DNA 寡聚物 (N3-ODN) 與具有各種接頭 (VHLL-X-BCN) 的雙環(huán)辛炔 (BCN) 修飾的 VHL 配體結(jié)合。在去除多余配體 VHLL-X-BCN 的簡(jiǎn)單純化過(guò)程后，TF-PROTAC 已準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過(guò) DNA 寡核苷酸鏈的選擇性識(shí)別并結(jié)合特定TF，使其降解。

       目前開(kāi)發(fā)了兩個(gè)基于 VHL 的 TF-PROTAC，NF-κB-PROTAC (dNF-κB) 和 E2F-PROTAC (dE2F)，分別有效降解細(xì)胞中的內(nèi)源性 p65 和 E2F1 蛋白，并在細(xì)胞中顯示出優(yōu)異的抗增殖活性?？偟膩?lái)說(shuō)， TF-PROTACs 提供了一個(gè)可通用的平臺(tái)來(lái)實(shí)現(xiàn) TFs 的選擇性降解，但因?yàn)槿鄙袤w內(nèi)數(shù)據(jù)，其臨床應(yīng)用仍有待確定。

       總結(jié)

       盡管基于小分子的 PROTAC 在臨床上已顯示巨大的前景，但尋找合適的配體來(lái)選擇性地靶向轉(zhuǎn)錄因子依然挑戰(zhàn)重重。由于寡核苷酸 DNA 是轉(zhuǎn)錄因子的天然配體，基于寡核苷酸的 PROTAC 具有普遍性和靈活性，并且可以通過(guò)替換嵌合寡核苷酸的 DNA 序列來(lái)靶向其他轉(zhuǎn)錄因子，從而為靶向傳統(tǒng)上不可成藥的轉(zhuǎn)錄因子鋪平道路。此外，鑒于寡核苷酸具有穩(wěn)定性、組織滲透性，免疫原性和低毒 性等特點(diǎn)，基于寡核苷酸的 PROTAC 平臺(tái)為臨床開(kāi)發(fā)治療性PROTAC提供廣泛前景。

       盡管如此，它們的臨床前和臨床開(kāi)發(fā)也存在眾多挑戰(zhàn)，如寡核苷酸的 PROTAC 總是帶有大量負(fù)電荷，并且其次優(yōu)的藥代動(dòng)力學(xué)和相對(duì)較低的藥效可能會(huì)限制其未來(lái)發(fā)展。

       作為該技術(shù)的未來(lái)拓展，RNA結(jié)合蛋白可以通過(guò)RNA識(shí)別序列形成RNA-蛋白相互作用參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括RNA轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯，鑒于轉(zhuǎn)錄因子和 RNA 結(jié)合蛋白之間的相似性，基于寡核苷酸的 PROTAC 為此類(lèi)蛋白質(zhì)的靶向降解提供思路。隨著技術(shù)的成熟，確定基于 DNA 和 RNA 的 PROTAC 的臨床應(yīng)用前景值得期待。

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