IF 45.8 ! Science新發(fā)現(xiàn)：分子膠降解劑中的靶標(biāo)拓展！

       蛋白質(zhì)降解在細(xì)胞生物學(xué)中扮演著至關(guān)重要的角色，它不僅參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的維持，還與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來，分子膠降解劑（Molecular Glue Degradators, MGDs）作為一種新興的蛋白質(zhì)降解策略，引起了廣泛關(guān)注。MGDs通過誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白與E3泛素連接酶之間的相互作用，促使目標(biāo)蛋白的泛素化和降解，為治療多種難以成藥的疾病提供了新的思路。在這一領(lǐng)域，CRBN（Cereblon）作為E3泛素連接酶CRL4CRBN的底物受體，已被證明是MGDs的關(guān)鍵靶點(diǎn)。CRBN能夠通過特定的G-loop結(jié)構(gòu)識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)蛋白（該結(jié)構(gòu)在人類蛋白質(zhì)組中普遍存在），從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的降解。然而，目前對(duì)于CRBN靶標(biāo)空間的探索還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，尤其是在G-loop結(jié)構(gòu)之外，是否存在其他能夠被CRBN識(shí)別的結(jié)構(gòu)或機(jī)制，仍然是一個(gè)亟待解決的問題。

       2025年7月3日，來自美國Monte Rosa Therapeutics公司的研究團(tuán)隊(duì)在Science期刊上公布了一篇名為"Mining the CRBN target space redefines rules for molecular glue-induced neosubstrate recognition"的文章，對(duì)這一問題進(jìn)行了深入探究。

       文章標(biāo)題，來源：doi/10.1126/science.adt6736

       該文章主要描述了關(guān)于分子膠降解劑（MGDs）的研究，特別是它們?nèi)绾瓮ㄟ^誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白與E3泛素連接酶CRL4CRBN之間的接近性，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的泛素化和降解。研究人員通過計(jì)算匹配算法和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，系統(tǒng)地探索了CRBN靶標(biāo)空間，并重新定義了MGD誘導(dǎo)的新底物識(shí)別規(guī)則，為未來的小分子藥物開發(fā)提供了新的靶點(diǎn)和機(jī)制。

       CRBN靶標(biāo)空間在G-loop內(nèi)的擴(kuò)展以及超越G-loop的拓展

       分子膠降解劑（MGDs）是一類小分子化合物，它們通過一種通用的G-loop識(shí)別結(jié)構(gòu)將目標(biāo)蛋白招募至CRBN。研究人員利用結(jié)構(gòu)化的G-loop模板進(jìn)行的計(jì)算匹配算法預(yù)測(cè)了1600多種人類蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)具有表面暴露且與CRBN兼容的β-發(fā)夾或螺旋G-loop結(jié)構(gòu)?；诒砻娴哪M搜索方法突破了G-loop模式，并為擴(kuò)展CRBN靶標(biāo)空間至G-loop降解之外提供了機(jī)會(huì)。

       研究方法與結(jié)果

       β-發(fā)夾G-loop靶標(biāo)空間的探索與驗(yàn)證

       通過計(jì)算方法挖掘人類蛋白質(zhì)組中與CRBN兼容的β-發(fā)夾G-loop蛋白質(zhì)。研究人員使用CK1α的β-發(fā)夾G-loop作為模板，從PDB和AlphaFold2模型中識(shí)別出6123個(gè)G-loop結(jié)構(gòu)，分布在1424 個(gè)蛋白質(zhì)中，這些結(jié)構(gòu)不僅涵蓋了已知的β-發(fā)夾G-loop靶標(biāo)（例如IKZF1、IKZF2、GSPT1等），還包含大量C2H2鋅指蛋白（C2H2 ZF）。除此之外，還有912個(gè)非C2H2類的β-發(fā)夾G-loop樣結(jié)構(gòu)，它們分布在729種蛋白質(zhì)中，涉及96個(gè)不同的蛋白質(zhì)類別和272種結(jié)構(gòu)域類型。通過TurboID鄰近標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜分析驗(yàn)證了MGDs對(duì)預(yù)測(cè)靶標(biāo)的招募能力，并使用TR-FRET和NanoBRET技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了多個(gè)靶標(biāo)的三元復(fù)合物形成，包括NEK7、MNAT1、PPIL4等，又通過突變實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了G-loop在CRBN結(jié)合中的關(guān)鍵作用。

       新鑒定的非C2H2鋅指蛋白類的β-發(fā)夾G-loop靶標(biāo)

       聚焦于驗(yàn)證非C2H2鋅指蛋白類的β-發(fā)夾G-loop靶標(biāo)。

       研究人員選擇了多個(gè)非C2H2鋅指蛋白類的β-發(fā)夾G-loop靶標(biāo)進(jìn)行NanoBRET驗(yàn)證，包括PPIL4、MNAT1、WBP4、LIMD1、CHD7、ASS1、HNRNPD、RELB、GTF2B、MAD2L1和KIFC3等。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些靶標(biāo)的三元復(fù)合物形成，并通過突變實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了G-loop在CRBN結(jié)合中的關(guān)鍵作用。這些靶標(biāo)覆蓋了多種不同的蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)域類型，進(jìn)一步擴(kuò)展了CRBN的靶標(biāo)空間。

       發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)上不同的螺旋G-loop結(jié)構(gòu)

       探索CRBN是否能夠通過螺旋G-loop結(jié)構(gòu)識(shí)別靶標(biāo)。

       研究人員使用最小化的G-loop模板（5個(gè)殘基）進(jìn)行計(jì)算挖掘，識(shí)別出1633種蛋白質(zhì)，其中包括184種攜帶螺旋G-loop的蛋白質(zhì)。通過TR-FRET和NanoBRET技術(shù)驗(yàn)證了mTOR-FRB和多個(gè)酪氨酸激酶（如LCK、HCK、LYN）的三元復(fù)合物形成，并解析了mTOR-FRB與CRBN復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，螺旋G-loop通過其C端與CRBN的CULT結(jié)構(gòu)域相互作用，形成與β-發(fā)夾G-loop相似的氫鍵，盡管在結(jié)構(gòu)上有所不同，但都能被CRBN識(shí)別。

       NEK7通過分化的PPI界面與CRBN結(jié)合

       研究NEK7與CRBN的結(jié)合機(jī)制，并探索其降解機(jī)制。

       研究人員通過化合物篩選發(fā)現(xiàn)化合物5能夠誘導(dǎo)NEK7（即NIMA-related kinase 7，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用）的降解，并且這種降解可以通過MLN-4924或lenalidomide競(jìng)爭(zhēng)抑制。研究人員還解析了NEK7與CRBN復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，NEK7通過其β-發(fā)夾G-loop與CRBN結(jié)合，但結(jié)合方式與CK1α有所不同。NEK7的N端擴(kuò)展區(qū)域?qū)RBN的結(jié)合至關(guān)重要，這種擴(kuò)展界面在NEK7的降解中起關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)揭示了CRBN與不同靶標(biāo)結(jié)合的多樣性和靈活性。

       VAV1通過分子表面模擬GSPT1 degron與CRBN結(jié)合

       探索VAV1是否能夠通過非G-loop依賴的方式與CRBN結(jié)合。

       研究人員使用表面匹配算法，識(shí)別VAV1（即Vav鳥嘌呤核苷酸交換因子1，是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在免疫細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中具有關(guān)鍵作用）的SH3c結(jié)構(gòu)域與GSPT1 degron之間的表面相似性，并通過TR-FRET和NanoBRET技術(shù)驗(yàn)證了VAV1與CRBN的結(jié)合。解析的晶體結(jié)構(gòu)顯示，VAV1的SH3c結(jié)構(gòu)域通過其RT-loop與CRBN的關(guān)鍵殘基形成氫鍵，模擬GSPT1 degron的結(jié)合方式，VAV1與CRBN的結(jié)合方式與GSPT1相似，但缺乏結(jié)構(gòu)同源性。VAV1的RT-loop中的特定殘基（如R798和S799）對(duì)CRBN的結(jié)合至關(guān)重要。這些結(jié)果表明，VAV1通過分子表面模擬與CRBN結(jié)合，進(jìn)一步擴(kuò)展了CRBN的靶標(biāo)空間。

       CRBN預(yù)測(cè)的PPI熱點(diǎn)區(qū)域和已知新底物的足跡

       展示CRBN表面的PPI熱點(diǎn)區(qū)域，并映射已知新底物的結(jié)合足跡。

研究人員使用MaSIF程序計(jì)算CRBN表面的PPI傾向，并預(yù)測(cè)PPI熱點(diǎn)區(qū)域。結(jié)果表明，CRBN表面的PPI熱點(diǎn)區(qū)域具有高PPI傾向，這些區(qū)域與已知新底物的結(jié)合足跡高度重合。不同新底物通過不同的結(jié)合模式與CRBN的PPI熱點(diǎn)區(qū)域相互作用，展示了CRBN的多功能性和靶標(biāo)空間的多樣性。

       結(jié)語

       回顧上文，我們已經(jīng)了解到：除了已知的β-發(fā)夾G-loop外，還存在一種新的螺旋G-loop結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)也能被CRBN識(shí)別。這表明CRBN的靶標(biāo)空間可以擴(kuò)展到G-loop樣基序之外。

       VAV1蛋白的C末端SH3結(jié)構(gòu)域（SH3c）雖然缺乏G-loop結(jié)構(gòu)特征，但也能通過分子表面模擬機(jī)制與CRBN結(jié)合。這種結(jié)合依賴于VAV1 SH3c結(jié)構(gòu)域的獨(dú)特折疊，它通過形成與CRBN的關(guān)鍵氫鍵接觸來模擬G-loop的相互作用。

       CRBN具有極高的多功能性，能夠通過不同的表面特征與多種靶標(biāo)結(jié)合。這種多功能性為MGDs的開發(fā)提供了更廣泛的靶標(biāo)選擇。

       這項(xiàng)研究不僅擴(kuò)展了CRBN的靶標(biāo)空間，還重新定義了MGD誘導(dǎo)的新底物識(shí)別規(guī)則，為開發(fā)新一代MGDs提供了理論基礎(chǔ)。通過計(jì)算和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，研究人員能夠系統(tǒng)地探索和驗(yàn)證CRBN的潛在靶標(biāo)，為未來的小分子藥物開發(fā)提供了新的靶點(diǎn)和機(jī)制。