自 CRISPR-Cas9 基因組編輯技術(shù)問世以來，人們?yōu)橥卣蛊鋺梅秶冻隽舜罅颗?，從而開發(fā)出了堿基編輯器（Base editor，BE）和先導編輯器（Prime editor，PE）。
堿基編輯器能夠轉(zhuǎn)換單個或少數(shù)幾個堿基，而先導編輯器能夠引入堿基替換以及小的片段插入和缺失。由于其靈活性和精準性，先導編輯器在包括細胞和基因治療以及疾病建模在內(nèi)的治療應用方面正受到越來越多的關注。然而，先導編輯器受限于其較低的編輯效率，因此，人們探索了各種策略以提高先導編輯效率。
2025 年 8 月 5 日，首爾國立大學醫(yī)學院的研究人員在國際頂尖學術(shù)期刊 Cell 上發(fā)表了題為：AI-generated MLH1 small binder improves prime editing efficiency 的研究論文。
該研究利用 David Baker 團隊開發(fā)的 AI 蛋白質(zhì)設計工具--RFdiffusion，設計了靶向抑制錯配修復（MMR）通路的 MLH1 小型結(jié)合蛋白（MLH1-SB），并使用 AlphaFold3 從設計的候選蛋白中高效篩選最佳蛋白--一個僅由 82 個氨基酸組成的 MLH1-SB，其可與當前的各種先導編輯器兼容適配，在人類細胞和小鼠體內(nèi)大幅提高先導編輯效率。
這項研究凸顯了生成式人工智能（generative AI）在推進基因組編輯技術(shù)方面的巨大潛力。
PE2 是一種優(yōu)化的 PE 架構(gòu)，由融合了逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）的 Cas9 切口酶（nCas9）組成，可在目標位點合成包含所需編輯的 DNA 鏈。此過程依賴于作為逆轉(zhuǎn)錄模板的先導編輯向?qū)?RNA（pegRNA）的 3' 端延伸。為了提高 PE 的效率，PE3 和 PE5 采用了一種額外的切口向?qū)?RNA（ngRNA），在未編輯的鏈上制造第二個切口，使懸突平衡（flap equilibrium）向期望的編輯方向偏移。
進一步的研究表明，細胞中固有的錯配修復（MMR）途徑會阻礙在目標位點上所需編輯的整合。在錯配修復中，MutS 同源物（MutSα 由 MSH2-MSH6 組成，MutSβ 由 MSH2-MSH3 組成）識別錯配，并招募 MutLα 復合物（由 MLH1 和 PMS2 組成）以促進修復。
因此，抑制關鍵的錯配修復組分（例如 MSH2、MSH3、MSH6、MLH1 和 PMS2）可顯著提高 PE 效率?；谶@一點，PE4 通過同時遞送 MLH1dn 蛋白（用于移植 MutLα 復合物）和先導編輯器，以提高 PE 效率。然而，近期的研究顯示，只有對大約 10 bp 或更小片段的編輯時，抑制 MMR 途徑才能提高 PE 效率。
為了進一步提高 PE 效率，在 pegRNA 的 3' 末端引入了 RNA 假結(jié)結(jié)構(gòu)基序，以增強其穩(wěn)定性并防止 3' 末端延伸部分的降解。此外，利用噬菌體輔助連續(xù)進化技術(shù)（PACE）進行蛋白質(zhì)進化，已開發(fā)出多種 PE6 架構(gòu)，其編輯效率得到了提高。
此外，還有研究使用小 RNA 結(jié)合外切核酸酶保護因子 La 來保護 pegRNA 的 3' 端，從而開發(fā)了效率更高的 PE7。
盡管上述研究在提高先導編效率術(shù)方面取得了許多進步，但其編輯效率仍不盡如人意，尤其是在治療應用方面。此外，重要的是要在不使用切口向?qū)?RNA（ngRNA）的情況下改進先導編輯結(jié)構(gòu)，因為 ngRNA 可能會引入意外的插入/缺失突變。
近年來，人工智能（AI）技術(shù)的進步使得基于序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測以及蛋白質(zhì)的從頭設計成為可能。而且，AI 技術(shù)已被應用于開發(fā)基于 CRISPR 基因編輯工具。
但 AI 驅(qū)動的 CRISPR 基因組編輯改進，主要集中在提高關鍵酶（例如核酸酶 Cas9 和 脫氨酶 TadA）的催化活性上。此外，諾獎得主、蛋白質(zhì)設計先驅(qū) David Baker 開發(fā)的 用于設計結(jié)合蛋白的 AI 工具--RFdiffusion，很大程度上僅限于設計單結(jié)合位點結(jié)合蛋白以及抗體。
在這項最新研究中，研究團隊利用 RFdiffusion 來抑制錯配修復（MMR）通路，從而提高先導編輯（PE）效率。
這是通過兩步策略實現(xiàn)的：1）從頭設計具有多個結(jié)合位點的全新蛋白質(zhì)，包括一個非競爭性錨定位點、一個靶向關鍵活性的抑制位點以及一個單純的競爭性結(jié)合位點；2）采用基于 AlphaFold3 的篩選系統(tǒng)來挑選最佳候選蛋白質(zhì)。
通過這種方法，研究團隊利用 RFdiffusion 生成了一系列 MLH1 的小型結(jié)合蛋白--MLH1-SB，顯著提高了 PE 效率，并且與現(xiàn)有的 PE 架構(gòu)兼容，包括 PE2、PEmax、PE6 和 PE7。
在這些生成的 MLH1-SB 中，研究團隊從中確定了一個僅由 82 個氨基酸組成的最優(yōu) MLH1-SB，其緊湊的結(jié)構(gòu)使其能夠無縫整合到現(xiàn)有的 PE 架構(gòu)（PEmax、PE6 和 PE7）中，從而開發(fā)出諸如 PEmax-SB、PE6-SB 和 PE7-SB 這樣的 PE-SB 平臺。相比之下，MLH1dn 蛋白的多達 753 個氨基酸，體積龐大，難以整合和遞送。
值得注意的是，PE7-SB2 系統(tǒng)通過融合了兩個 MLH1-SB，在人類細胞中表現(xiàn)出顯著提高的 PE 效率，分別比 PEmax 和 PE7 提高了約 18.8 倍和 2.5 倍。此外，體內(nèi)研究顯示，在小鼠體內(nèi)，PE7-SB2 的 PE 效率相比 PE7 提高了約 3.4 倍。
鑒于腺相關病毒（AAV）和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）等體內(nèi)基因治療遞送方法的有效載荷能力，該研究中通過 AI 從頭設計并生成的 MLH1-SB 能夠在保持最小尺寸的同時顯著增強 PE 效率，預計將促進高效的體內(nèi)基因編輯療法的開發(fā)。
該研究的亮點：
RFdiffusion 生成的 MLH1 小型結(jié)合蛋白（MLH1-SB）抑制錯配修復活性；
AlphaFold 3 識別出有效的 MLH1 小型結(jié)合蛋白；
MLH1 小型結(jié)合蛋白可提高先導編輯效率且毒性有限；
MLH1 小型結(jié)合蛋白的緊湊尺寸使其能夠集成到先導編輯架構(gòu)中。
最后，研究團隊表示，生成式人工智能（generative AI）工具的快速發(fā)展正在改變學術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的研究格局。該研究中使用了便捷的網(wǎng)頁版 RFdiffusion，僅用 3 天時間就快速生成了 MLH1-SB，而且無需本地高算力支持，此外，使用 AlphaFold3 高效篩選蛋白，只用了 1 天時間，整個過程僅花費 4 天時間。這種高成功率、高效率，大大縮短了后續(xù)實驗所需的時間和成本。
論文鏈接：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00799-8
合作咨詢
肖女士
021-33392297
Kelly.Xiao@imsinoexpo.com
2006-2025 上海博華國際展覽有限公司版權(quán)所有（保留一切權(quán)利）
滬ICP備05034851號-57
